北京专科白癜风医院 http://baidianfeng.39.net/bdfby/yqyy/遗传性凝血因子Ⅻ(coagulationfactorⅫ，FⅫ)缺陷症是由于编码FⅫ蛋白的基因突变所引起的一种常染色体遗传病，多数遗传性FⅫ缺陷症患者呈常染色体隐形遗传，少数患者表现为显性遗传。遗传性FⅫ缺陷症患者不表现自发性出血或严重的损伤后出血等其他凝血因子缺乏所具有的临床症状，该病在人群中的发病率不明，患者多在术前凝血筛查时由于活化部分凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintime,APTT)延长而被发现。本研究中，针对2个汉族遗传性FⅫ缺陷症家系进行了家系调查、临床诊断、表型诊断和基因检测，发现了2个目前首次报道的F12基因突变。
对象与方法
一、对象
1．先证者-1：
男，34岁。年3月因"阑尾炎"医院，准备手术切除。术前凝血象检查示APTT是s、凝血酶原时间(prothrombintime，PT)是11.6s。患者自出生未有异常出血史。先证者父母为近亲婚配。家系中其他成员均无出血史和血栓史。家系图见图1。
图1
2个遗传性FⅫ缺陷症家系图
2．先证者-2：
女，76岁。年10医院体检时常规门诊凝血筛查发现APTT升高。常规凝血象检查示APTT是s、PT是11.5s。患者自出生未有异常出血史，月经量正常，分娩时出血量正常。无出血病和血栓家族史。先证者父母早年去世，不确定是否近亲婚配。家系中其他成员均无出血史和血栓史。家系图见图1。
3．健康对照组：
名，男58名，女45名，平均年龄33岁(20～45岁)，均为年5医院的健康体检者。对照者经查均无肝肾功能疾病，无血栓和出血史。征求本人同意，对上述人员采集血样。
本医院医学伦理委员会审核，项目名称是"两个遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症家系临床表型和基因型变化的分析"，批号XHEC-D--，患者及家属均签署了知情同意书。
二、材料与方法
1．标本采集和处理：
标本采集在征得患者及其家系成员知情同意后进行，采取其外周静脉血，并以1/10体积0.mol/L枸橼酸钠抗凝。4℃×g离心10min，分离乏血小板血浆后，立即进行凝血活性检测或于－80℃冻存备用。
2．凝血功能检测：
APTT、PT、凝血酶时间(thrombintime，TT)、纤维蛋白原(fibrinogen，Fg)、凝血因子Ⅻ活性(FⅫ：C)、凝血因子Ⅺ活性(FⅪ：C)、凝血因子Ⅷ活性(FⅧ：C)、凝血因子Ⅸ活性(FⅨ：C)、狼疮抗凝物(lupusantigoagulant，LAC)等试剂为美国IL(InstrumentationLaboratory)公司产品，仪器为ACLTOP(美国InstrumentationLaboratory公司)，因子活性检测采用一期法，FⅫ抑制物检测采用Nijmegen法，严格按照说明书操作。FⅫ抗原(FⅫ：Ag)采用酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)法测定，羊抗人FⅫIgG(加拿大CedarlaneLab公司)为包被抗体，过氧化物酶连接的羊抗人FⅫIgG为检测抗体(加拿大CedarlaneLab公司)。
3．DNA抽提：
外周血细胞基因组DNA标本提取用血液基因组DNA提取试剂盒(天根公司产品)提取家系所有成员外周血基因组DNA，－80℃保存备用。
4．引物序列：
聚合酶链反应(PCR)扩增F12基因所有外显子及其侧翼序列根据参考文献[2,3]设计8对引物，分别扩增F12基因的14个外显子及其侧翼序列以及F12基因的5′端非翻译区(5′-UTR)和3′端非翻译区(3′-UTR)序列。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。
表1
F12基因的PCR扩增引物
5．PCR扩增、产物纯化和测序：
先扩增先证者的F12基因各个外显子及侧翼序列，发现突变区域后，再扩增其他家系成员的相应片段。PCR反应条件：95°C变性2min，然后95°C30s,53°C～59°C30s,72°C30s,30个循环后，72°C延伸10min。PCR仪为ABVeritiTM96-wellThermalCycler(美国AppiledBiosystems公司)。
PCR产物的鉴定与回收是取PCR产物2μl进行琼脂糖凝胶电泳(1%，Sangon)，如条带单一，则使用DNA回收试剂盒回收剩余产物(TIANquick普通DNA产物纯化试剂盒)。如有非特异性条带存在，则将剩余产物重新进行琼脂糖凝胶电泳，切取正确的条带后进行回收(TIANgel琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒)。
PCR产物的测序分析是PCR产物经纯化后，在ABI-XLDNA测序仪(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,US)上直接测序。测序结果与CoolDE文献[4]及GeneBankGI的F12基因序列比较，对含突变的序列进行反向测序确认。家系成员DNA则仅在先证者F12基因突变区域扩增后进行测序。
6．正常人群中基因多态性的筛查及突变的确认：
针对先证者外显子发现的突变，采用在正常人群中进行相应区域的PCR扩增结合测序的方法进行多态性筛查。
结果
一、凝血象检测结果
2例先证者APTT均明显延长，FⅫ：C和FⅫ：Ag含量均极度降低，其余内源性凝血因子FⅧ：C、FⅨ：C和FⅪ：C基本在正常范围内，LAC和FⅫ抑制物正常。2例先证者及家系成员的凝血指标检测结果见表2。
表2
2个FⅫ缺陷症家系凝血指标检测结果
二、F12基因分析及基因多态性排除
1．先证者-1
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F12基因14个外显子及其侧翼序列以及5′-UTR序列测序分析共发现3个与GeneBankGI序列和Cool等[4]报道的F12cDNA序列不同的位点。(1)5′-UTR的c.46C/C；(2)第11外显子F12cDNA的c.CT(p.QStop)(图2)；(3)第7外显子F12cDNA的c.GC(p.AP)。经数据库检索，c.CT(p.QStop)是新发现的F12基因突变，其他两处变异是已经证实的F12基因多态性。对家系成员测序分析结果表明，先证者c.CT突变遗传于父亲和母亲，双方在该位点均为杂合突变。
图2
先证者1测序图。箭头所指为突变位点，测序引物为5′端引物
2．先证者-2：
F12基因14个外显子及其侧翼序列以及5′-UTR序列测序分析共发现3个与GeneBankGI序列和Cool等[4]报道的F12cDNA序列不同的位点。(1)5′-UTR的c.46CCT；(2)第13外显子F12cDNA的c.TC(p.LP)(图3)；(3)第7外显子F12cDNA的c.GC(p.AP)。经数据库检索，c.TC(p.LP)是新发现的F12基因突变，其他两处变异是已经证实的F12基因多态性。对家系成员测序分析结果表明，先证者的两个儿子在该位点均为c.TTC杂合突变。
图3
先证者2测序图。箭头所指为突变位点，测序引物为5′端引物
讨论
FⅫ是内源凝血途径中第一个启动的凝血因子，主要由肝脏合成。编码FⅫ的F12基因位于5号染色体长臂5q33-qter，长约12kb，由14个外显子和13个内含子组成。F12cDNA全长bp，由49bp5′-UTR(untranslatedregion),bp氨基酸编码区和bp3′-UTR组成。与其他凝血因子相同，FⅫ也是一种丝氨酸蛋白酶，是由个氨基酸残基组成的单链糖蛋白，相对分子质量为。成熟FⅫ蛋白可分为数个结构/功能区：自氨基末端开始分别是Ⅱ型纤维连接蛋白区、EGF区、Ⅰ型纤维连接蛋白区、EGF区、Kringle区、富脯氨酸区以及催化区，其酶活性中心由位于催化区的His、Asp和Ser组成。至今，FⅫ是唯一一个未阐明完整晶体结构的凝血因子。
遗传性FⅫ缺陷症，最早由Ratnoff和Colopy于年首次报道。当时发现该患者主要表现有凝血时间延长、凝血活酶生成不良、凝血酶原消耗不佳，但这些异常能被血友病A、B或因子Ⅺ缺乏症患者的血浆纠正，且临床表现无异常出血。正因为没有特征性的临床表现，遗传性FⅫ缺陷症往往是在术前筛查时被发现。FⅫ缺乏患者大部分是真正的缺乏，即FⅫ抗原和活性同时严重减少(CRM－)。迄今为止，只有一少部分FⅫ抗原和活性不一致的报道，这些患者的FⅫ抗原含量在正常范围内，主要是由于FⅫ结构的异常导致其活性显著下降，表现为CRM＋[6,7,8]。本研究中的2例遗传性FⅫ缺陷症家系先证者FⅫ抗原和活性都同时下降，均为CRM－。
目前为止，国际上已报道F12突变逾50多个，国内也有多例报道[9,10,11]。在所有已经报道的突变中，错义突变占多数，且绝大多数发生在蛋白催化功能区(V-S)。本研究中发现的两个突变，c.CT(p.QStop)和c.TC(p.LP)都是发生在蛋白催化功能区，后者与戴利亚等[9]报道的突变蛋白位置是一致的，即c.TG(p.LR)。由于目前FⅫ的结构仍未完全阐明，因此对于各结构域的功能只是个推测。发生在FⅫ蛋白催化功能区的突变，在不能被充分激活的情况下可能会影响其正常发挥应有的生物学功能。
F12基因中存在46C/T多态性位点，该位点在东方人群中的等位基因频率为0.27/0.73，而在高加索人中为0.8/0.2。研究表明正常个体携带46C/C和46T/T的FⅫ抗原水平分别为%和61%。这表明46T的F12单倍体表达的FⅫ蛋白与46C的F12单倍体表达的FⅫ蛋白的比例是1∶3。本研究的2个家系中，也发现了46C/T多态性位点，家系1先证者是46C/C，家系成员也均是46C/C；家系2先证者为46C/T，其一个儿子为46T/T，另一个儿子为46C/C；家系2基因型为46C/C儿子的FⅫ：C正好是基因型46T/T儿子的3倍，与文献报道的结论一致。
在早期的凝血理论中，FⅫ被认为是接触凝血系统的成分之一，但近十年的研究表明，FⅫ在血栓形成过程中起重要作用，在内源凝血过程中不是必需的。FⅫ缺陷不引起异常出血，这在人和动物中的表现是一样的；然而FⅫ在血栓形成中的作用，人和动物的表现不一致，尽管本研究中的2个家系先证者均无血栓形成史，但是第1例报道的FⅫ缺陷症患者JohnHageman是死于肺栓塞，随后一些研究中也没有发现FⅫ缺失与血栓形成有关，也没有明确FⅫ缺陷会减低血栓形成风险。然而，最新的研究指出FⅫ只参与血栓形成而不参与止血过程，对于血栓的形成是必需的。目前的抗凝治疗主要为肝素，维生素K拮抗剂或者FⅩa间接抑制剂。针对凝血途径中关键蛋白的这些药物，他们的缺点就是会引起出血。临床医生需要权衡所用的抗凝剂在抗血栓和出血两方面的利害关系。如果FⅫ缺乏确实如F12基因敲除小鼠所表现的那样，可对抗血栓形成且不增加出血并发症的发生，则可使FⅫ成为一种理想的抗栓药物靶点。因此，透彻阐述FⅫ的结构与功能对深入了解FⅫ的本质及调控其功能至关重要。
综上所述，本研究在2个家系中发现2个F12基因变异c.CT(p.QStop)和c.TC(p.LP)，两者均是国际上首次报道的F12基因突变。
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